Es una de las Iglesias de Florencia más antiguas, consagrada en el 393 a San Ambrosio, obispo de Milán. Durante tres siglos fue la primera catedral florentina y conservaba los restos de San Zanobi, primer obispo de Florencia, que después pasaron a Santa Reparata. La basílica actual fue construida sobre la original a partir de 1419 por voluntad del fundador de la familia de los Médicis, Giovanni di Bici, que contrató para el proyecto a Filippo Brunelleschi. La relación entre los Médicis y el clero florentino era tan buena que la basílica fue el lugar de sepultura de Giovanni, Cosme y otros muchos sucesores. Las obras duraron mucho tiempo y se terminaron, excepto la fachada, en 1461, gracias a la contribución de Cosme el Viejo, hijo de Giovanni. La fachada de la iglesia está sin terminar, a pesar de los diferentes proyectos, como el que el papa León X le propuso en 1518 a Miguel Ángel. A finales del siglo XVI, al lado de la basílica, se construyó la Capilla de los Príncipes, para las tumbas monumentales de los componentes de la familia Médicis. La pequeña torre de la basílica es del año 1740.
El interior de la basílica tiene una estructura de cruz latina con tres naves dividas por columnas corintias con arcos de medio punto de piedra serena. La elegancia del interior se debe al estilo renacentista con proporciones armónicas y a su rigor geométrico. Durante la visita del edificio, se merecen una atención especial el tabernáculo de mármol, la Capilla de los Ginori, la Capilla Mayor y la Capilla Martelli, en la que hay obras de Donatello, Filippo Lippi y Desiderio da Settignano.
Por el transepto de la izquierda se va a la sacristía vieja, una sugestiva obra renacentista de Brunelleschi. La planta cuadrada y las perfectas formas geométricas, decoradas por Donatello, hacen que esta sacristía sea uno de los mejores ejemplos de arquitectura renacentista. Junto a la sacristía vieja se construyó, en 1520, la sacristía nueva, espléndida obra de Miguel Ángel.